{"id":278,"date":"2025-02-08T18:12:01","date_gmt":"2025-02-08T21:12:01","guid":{"rendered":"https:\/\/wp.ufpel.edu.br\/lmaia\/?page_id=278"},"modified":"2025-02-11T14:55:11","modified_gmt":"2025-02-11T17:55:11","slug":"rnaseq-via-hisat2","status":"publish","type":"page","link":"https:\/\/wp.ufpel.edu.br\/lmaia\/rnaseq-via-hisat2\/","title":{"rendered":"RNASEq via HISAT2"},"content":{"rendered":"

Protocolo testado utilizando o Linux Ubuntu 24 LTS<\/span><\/strong><\/h2>\n

Os passos iniciais s\u00e3o utilizados para instala\u00e7\u00e3o dos softwares necess\u00e1rios, prepara\u00e7\u00e3o da estrutura de diret\u00f3rios e obten\u00e7\u00e3o dos arquivos utilizados.<\/span><\/h2>\n

1)Instala\u00e7\u00e3o do programa HiSat2:<\/strong><\/span>
\nNo terminal do linux, utilize o comando:<\/span>
\nsudo apt-get install hisat2<\/span><\/h2>\n

\"\"<\/span><\/p>\n

*a vers\u00e3o instalada foi 2.2.1<\/span><\/p>\n

2)Instala\u00e7\u00e3o do programa samtools:<\/strong><\/span>
\n*Version: 1.19.2<\/span><\/h2>\n

no terminal digite:<\/span><\/strong><\/span>
\nsudo apt update<\/span>
\nsudo apt install samtools<\/span><\/p>\n

2.1)caso queira remover uma instala\u00e7\u00e3o antiga, digite:<\/strong><\/span>
\nsudo apt remove samtools<\/span>
\nsudo apt autoclean && sudo apt autoremove<\/span><\/p>\n

3)Instala\u00e7\u00e3o do programa HTseq-count:<\/strong><\/span>
\nconsulte:<\/span>
\nhttps:\/\/shicheng-guo.github.io\/research\/1941\/01\/08\/HTseq<\/a><\/span>
\n<\/span><\/h2>\n

4)Criar estrutura de diret\u00f3rios:<\/strong><\/span>
\n4.1) criar um diret\u00f3rio chamado rna1:<\/strong><\/span>
\nmkdir rna1<\/span><\/span><\/h4>\n

entrar no diret\u00f3rio rna1:<\/strong><\/span>
\ncd rna1<\/span><\/span><\/p>\n

4.2) criar sub-diret\u00f3rios:<\/span><\/strong>
\nmkdir fastq<\/span><\/span>
\nmkdir ref<\/span><\/span>
\nmkdir bam<\/span><\/span><\/h4>\n

\"\"<\/span><\/p>\n

\"\"<\/span><\/p>\n

5) Fazer download do arquivos do genoma de referencia (em formato fasta) e de anota\u00e7\u00e3o dos genes (formato gtf ou gff3):<\/span><\/strong><\/h2>\n

*neste exemplo, ser\u00e3o utilizados dados do genoma do arroz, armazenados nos links:<\/span><\/p>\n

https:\/\/rapdb.dna.affrc.go.jp\/download\/archive\/irgsp1\/IRGSP-1.0_genome.fasta.gz<\/a>\u00a0\u00a0 – para arquivo das pseudo-mol\u00e9culas do genoma do arroz<\/span><\/p>\n

https:\/\/rapdb.dna.affrc.go.jp\/download\/archive\/irgsp1\/IRGSP-1.0_representative_transcript_exon_2024-07-12.gtf.gz<\/a>\u00a0 – para arquivo formato gtf, contendo anota\u00e7\u00e3o das coordenadas dos genes em cada cromossomo<\/span><\/p>\n

**ap\u00f3s o download, copie estes arquivos no diret\u00f3rio “ref”, contendo as informa\u00e7\u00f5es do genoma de refer\u00eancia.<\/span><\/p>\n

6<\/b><\/strong>) Fazer download do<\/b><\/strong>s<\/b><\/strong>\u00a0arquivos <\/b><\/strong>contendo o sequenciamento dos RNAs, em formato fastq<\/b><\/strong>:<\/b><\/strong><\/h2>\n

*exist\u00eam dois tipos de sequenciamento:<\/p>\n

SE (single end), onde somente um lado dos fragmentos s\u00e3o sequenciados.<\/p>\n

PE (paired end), onde os dois lados dos fragmentos s\u00e3o sequenciados. Neste caso, os dados de cada amostra sequenciada sao representados por dois arquivos, contendo as reads (sequencias) forward e reverse, separadamente.<\/p>\n

6.1)baixar os arquivos para o diret\u00f3rio fastq;<\/p>\n

link para arquivos:
\nhttps:\/\/docs.ufpel.edu.br\/index.php\/s\/6nDhkMF4ChgULFz<\/a><\/p>\n

sample1_1.fastq.gz
\nsample1_2.fastq.gz
\nsample2_1.fastq.gz
\nsample2_2.fastq.gz
\nsample3_1.fastq.gz
\nsample3_2.fastq.gz
\nsample4_1.fastq.gz
\nsample4_2.fastq.gz
\nsample5_1.fastq.gz
\nsample5_2.fastq.gz
\nsample6_1.fastq.gz
\nsample6_2.fastq.gz<\/p>\n

* \u00c9 importante informar que estes dados contem somente reads<\/em> pertencentes ao cromossomo 1 do arroz, derivados o trabalho de Amaral et al., (2016) https:\/\/link.springer.com\/article\/10.1007\/s10142-016-0507-y.<\/p>\n

***Estes dados representam uma parcela muito pequena do que realmente \u00e9 o transcriptoma do arroz, por isso as conclus\u00f5es obtidas neste exemplo s\u00e3o somente did\u00e1ticas.<\/p>\n

***estes dados foram reduzidos somente ao cromossomo 1 para facilitar a execu\u00e7\u00e3o did\u00e1tica dos m\u00e9todos.<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

================================================================================================<\/p>\n

***Os pr\u00f3ximos passos, s\u00e3o utilizados para a an\u00e1lise de fato.<\/span><\/h2>\n

7)Cria\u00e7\u00e3o do arquivo de \u00edndice para o genoma de refer\u00eancia:<\/strong><\/h2>\n

*na pasta “ref”, temos que descompactar os arquivos baixados.<\/h3>\n

\"\"<\/p>\n

7.1)comandos para descompactar arquivos:<\/strong><\/h3>\n

gunzip IRGSP-1.0_genome.fasta.gz<\/span>
\ngunzip IRGSP-1.0_representative_transcript_exon_2024-07-12.gtf.gz<\/span><\/h3>\n

resultado:<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

*posteriormente, \u00e9 aconselh\u00e1vel re-nomear os arquivivos para nomes mais simples\/curtos, exemplo:
\nIRGSP-1.0_genome.fasta
\npara
\ngenome.fasta<\/h3>\n

IRGSP-1.0_representative_transcript_exon_2024-07-12.gtf
\npara
\ngenes.gtf<\/h3>\n

para isso, use o comando move (mv):<\/span>
\nmv IRGSP-1.0_genome.fasta\u00a0 genome.fasta<\/span><\/span><\/span>
\nmv IRGSP-1.0_representative_transcript_exon_2024-07-12.gtf\u00a0 genes.gtf<\/span><\/span><\/span><\/h3>\n

resultado:\"\"<\/p>\n

7.2) comando para criar \u00edndice:<\/strong><\/h3>\n

hisat2-build -p 15 genome.fasta<\/span> genome_index<\/span><\/h3>\n

\"\"<\/p>\n

resultado:<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

8<\/b><\/strong>) Renomear as amostras (arquivos <\/b><\/strong>fastq)<\/b><\/strong>:<\/b><\/strong><\/h2>\n

*para facilitar o trabalho, \u00e9 importante renomear os arquivos fastq de acordo com nomes que facilitem a analise:<\/span>
\n**neste exemplo, o experimento \u00e9 composto de tr\u00eas repeti\u00e7\u00f5es (amostras) de uma cultivar de arroz nas condi\u00e7\u00f5es de estresse por ferro e sal, ent\u00e3o, vamos nomear cada arquivo conforme as informa\u00e7\u00f5es originais do experimento.<\/span>
\n***tamb\u00e9m podemos facilitar a compreens\u00e3o indicando nos nomes quem \u00e9 a amostra sequenciada no sentido forward e reverse.<\/span>
\n****por padr\u00e3o, arquivos com reads forward, recebem o numero 1 e reverse o numero 2:<\/span><\/h3>\n

exemplo:<\/span>
\nsample1_1.fastq.gz, equivale a: \u00a0 sample1_forward.fastq.gz ou sample1_f.fastq.gz<\/span>
\nsample1_2.fastq.gz, equivale a: \u00a0 sample1_reverse.fastq.gz ou sample1_r.fastq.gz<\/span><\/h3>\n

*****utilizaremos, somente f e r, para simplificar.<\/span><\/h3>\n

para este exemplo, as informa\u00e7\u00f5es das amostras est\u00e3o no arquivo<\/span><\/h2>\n

informacoes_amostras<\/span>.xlsx<\/span><\/span><\/a><\/p>\n

https:\/\/docs.ufpel.edu.br\/index.php\/s\/M30IxguzmuL1F9o<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

ent\u00e3o, utilizando o comando mv, podemos renomear os arquivos para:<\/p>\n

sample1_1.fastq.gz\u00a0\u00a0 – frio_r1_f.fastq.gz
\nsample1_2.fastq.gz\u00a0\u00a0 – frio_r1_r.fastq.gz<\/p>\n

sample2_1.fastq.gz\u00a0 – frio_r2_f.fastq.gz
\nsample2_2.fastq.gz\u00a0 – frio_r2_r.fastq.gz<\/p>\n

sample3_1.fastq.gz – frio_r3_f.fastq.gz
\nsample3_2.fastq.gz – frio_r3_r.fastq.gz<\/p>\n

——-<\/p>\n

sample4_1.fastq.gz – sal_r1_f.fastq.gz
\nsample4_2.fastq.gz – sal_r1_r.fastq.gz<\/p>\n

sample5_1.fastq.gz\u00a0 – sal_r2_f.fastq.gz
\nsample5_2.fastq.gz\u00a0 – sal_r2_r.fastq.gz<\/p>\n

sample6_1.fastq.gz\u00a0 – sal_r3_f.fastq.gz
\nsample6_2.fastq.gz\u00a0 – sal_r3_r.fastq.gz<\/p>\n

resultado:<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

9<\/b><\/strong>) Mapear as amostras (arquivos <\/b><\/strong>fastq) contra o genoma de refer\u00eancia (indexado)<\/b><\/strong>:<\/b><\/strong><\/h2>\n

*para isso permane\u00e7a no diret\u00f3rio “rna1”;
\n**certifique-se que foi criada a pasta “bam”;<\/h3>\n

***o comando utilizado ira ler os arquivos de reads da pasta “fastq”, o genoma de referencia da pasta “ref” e gravar as saidas na para “bam”;<\/h3>\n

no terminal digite:<\/h3>\n

\"\"<\/h3>\n

para amostra 1:<\/p>\n

hisat2 –rna-strandness RF –very-sensitive -k 5 -p 15 –dta -x ref\/genome_index<\/span>
\n-1 fastq\/frio_r1_f.fastq.gz<\/span> -2 fastq\/frio_r1_r.fastq.gz<\/span> -S bam\/frio1.sam<\/span> \u00a0–summary-file frio1_summary.txt<\/span><\/h3>\n

resultado:<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

para amostra 2:<\/p>\n

hisat2 –rna-strandness RF –very-sensitive -k 5 -p 15 –dta -x ref\/genome_index<\/span>
\n-1 fastq\/frio_r2_f.fastq.gz<\/span> -2 fastq\/frio_r2_r.fastq.gz<\/span> -S bam\/frio2.sam<\/span> \u00a0–summary-file frio2_summary.txt<\/span><\/h3>\n

****repetir para todas as amostras, alterando os nomes dos arquivos de\u00a0 entrada e sa\u00edda adequadamente<\/span><\/h3>\n

resultados:<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

10<\/b><\/strong>) Converter os arquivos formato “sam” para formato “bam” e orden\u00e1-los<\/b><\/strong>:<\/b><\/strong><\/h2>\n

10.1) converter sam para bam:<\/p>\n

entre na pasta bam e execute o comando:<\/p>\n

samtools view -@ 15 -S -b frio1.sam<\/span> > frio1.bam<\/span><\/p>\n

samtools view -@ 15 -S -b frio2.sam<\/span> > frio2.bam<\/span><\/p>\n

**repetir o comando para todas as amostras.<\/p>\n

10.2) ordenar arquivos “bam”:<\/p>\n

execute o comando:<\/p>\n

samtools sort -@ 15 -O BAM -o frio1sort.bam<\/span> frio1.bam<\/span><\/p>\n

\"\"<\/p>\n

**repetir o comando para todas as amostras.<\/p>\n

resultado:<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

 <\/p>\n

11<\/b><\/strong>) Contagem de reads mapeados nos genes anotados<\/b><\/strong>:<\/b><\/strong><\/h2>\n

v\u00e1 para a pasta “rna1” e execute o comando:<\/p>\n

para amostra 1:<\/p>\n

htseq-count –stranded=reverse -f bam bam\/frio1sort.bam<\/span> ref\/genes.gtf<\/span> > frio1_count.txt<\/span><\/p>\n

para amostra 2:<\/p>\n

htseq-count –stranded=reverse -f bam bam\/frio2sort.bam<\/span> ref\/genes.gtf<\/span> > frio2_count.txt<\/span><\/p>\n

**repetir o comando para todas as amostras.<\/p>\n

resultado:<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

**cada arquivo de contagem vai ter na primeira coluna a identifica\u00e7\u00e3o dos genes e a segunda coluna contendo o total de reads mapeados dentro daquele gene, conforme figura abaixo.<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

 <\/p>\n

12<\/b><\/strong>) Montagem de planilha do excel juntando os resultados de contagem de todas as amostras<\/b><\/strong>:<\/b><\/strong><\/h2>\n

** a partir desta ponto, as demais atividades podem ser feitas utilizando o Office e R no sistema MS-Windows.<\/p>\n

12.1) arquivo de contagens<\/strong><\/p>\n

exemplo:<\/p>\n

dados da amostra frio1_count.txt<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

dados da amostra frio2_count.txt<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

**unificando as planilhas:<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

*no excel, a primeira coluna devera receber os nomes dos genes e as demais, os nomes de cada amostra.
\n**na primeira linha dever\u00e3o ser colocados os nomes de cada coluna.
\na primeira devera ser nomeada como “gene” e as demais com o nome dos tratamentos e repeti\u00e7\u00e3o, conforme exemplo acima.
\n***\u00e9 importante manter padr\u00e3o na escrita, evitando espa\u00e7os, acentos, caracteres especiais e manter apenas letras min\u00fasculas, para simplificar.
\n****os dados do excel dever\u00e3o ser exportados para arquivo formato csv (contagem_final.csv), conforme exemplo abaixo:<\/p>\n

contagem_final.csv<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

12.2) arquivo com desenho experimental<\/strong><\/p>\n

no excel, monte um arquivo com a estrutura conforme a figura abaixo:<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

exporte esses dados para um arquivo csv chamado “metadata.csv”, por exemplo.<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

13<\/b><\/strong>) Instala\u00e7\u00e3o do R e demais pacotes<\/b><\/strong>:<\/b><\/strong><\/h2>\n

** a partir desta ponto, as demais atividades podem ser feitas utilizando o Office e R no sistema MS-Windows.<\/p>\n

a) Inicialmente necessitamos instalar o R e RStudio;<\/span><\/strong><\/p>\n

*neste exemplo foi utilizado o R vers\u00e3o 4.4.0, obtido em:<\/p>\n

https:\/\/cran.r-project.org\/bin\/windows\/base\/old\/<\/p>\n

ou<\/p>\n

https:\/\/cran.r-project.org\/bin\/windows\/base\/old\/4.4.0\/<\/p>\n

b) Instala\u00e7\u00e3o do DESeq2:<\/span><\/strong><\/p>\n

Inicialmente \u00e9 necess\u00e1rio instalar o gerenciador de pacotes, com os comandos:<\/p>\n

if (!require(“BiocManager”, quietly = TRUE))
\ninstall.packages(“BiocManager”)<\/p>\n

c) Instalar o DESeq:<\/p>\n

BiocManager::install(“DESeq2”)<\/p>\n

14<\/b><\/strong>) An\u00e1lise da express\u00e3o diferencial com o pacote DESeq2 no RStudio<\/b><\/strong>:<\/b><\/strong><\/h2>\n

*o protocolo descrito \u00e9 derivado (com algumas simplifica\u00e7\u00f5es) do artigo:<\/p>\n

Count-based differential expression analysis of RNA sequencing data using R and\u00a0 Bioconductor (Anders et al., 2013 – Nature Protocols)<\/p>\n

https:\/\/www.nature.com\/articles\/nprot.2013.099<\/p>\n

 <\/p>\n

14.1)leitura dos dados<\/strong><\/p>\n

#ler bibliotecas
\nlibrary( “DESeq2” )
\nlibrary(“ggplot2”)<\/p>\n

#define pasta<\/span>
\nsetwd(“e:\/rna1\/”)
\ngetwd()<\/p>\n

#ler dados de contagem<\/span><\/p>\n

countdata <- read.csv(“contagem_final.csv”, header = TRUE, sep = “,”)
\nhead(countdata)<\/p>\n

#ler dados da estrutura do experimento<\/span><\/p>\n

exp_design <- read.csv(“metadata.csv”, header = TRUE, sep = “,”)
\nexp_design<\/p>\n

#indicar que a coluna tratamento \u00e9 um fator<\/span><\/p>\n

exp_design$tratamento = factor(exp_design$tratamento)<\/p>\n

 <\/p>\n

#\u00e9 indicado fazer uma limpeza pr\u00e9via, excluindo genes com valor baixo de express\u00e3o ou zero, nesse caso ser\u00e1 utilizado um m\u00ednimo de 1 reads em todas a tr\u00eas amostras do frio OU do sal<\/p>\n

para ou utiliza-se o caractere pipe (“|”)<\/p>\n

minimo = 1
\ncountdata2 <- subset(countdata, (frio1 >= minimo & frio2 >= minimo & frio3 >= minimo) | (sal1 >= minimo & sal2 >= minimo & sal3 >= minimo))<\/p>\n

dim(countdata2)<\/p>\n

#criar dataset do deseq2<\/span><\/p>\n

\n

dds <- DESeqDataSetFromMatrix(\u00a0 \u00a0countData=countdata2 ,
\ncolData=exp_design,
\ndesign=~tratamento, tidy = TRUE)<\/p>\n

dds
\ndim(dds)<\/p>\n

resultado no console do R:<\/p>\n

\"\"<\/p>\n<\/div>\n

# filtragem 2<\/span>
\nsmallestGroupSize <- 3
\nvalor <- 1<\/p>\n

keep <- rowSums(counts(dds) >= valor) >= smallestGroupSize
\ndds <- dds[keep,]
\ndds
\ndim(dds)<\/p>\n

#indicar qual n\u00edvel do fator \u00e9 referencia no calculo de expressao diferencial<\/span>
\ndds$tratamento <- relevel(dds$tratamento, ref = “sal”)<\/p>\n

#executar a funcao DESeq para calculo da diferenca de expressao\u00a0<\/span>
\ndds <- DESeq(dds)
\nres <- results(dds)
\nres<\/p>\n

resultado console do R:<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

 <\/p>\n

#sum\u00e1rio dos resultados<\/span>
\nsummary(res)<\/p>\n

#exemplo de como selecionar somente os significativos<\/span>
\nres0.05 <- results(dds, alpha = 0.05)
\nsummary(res0.05)<\/p>\n

#nomes do contraste feito<\/span>
\nresultsNames(dds)<\/p>\n

resultado:<\/p>\n

“tratamento_frio_vs_sal”<\/span><\/span><\/p>\n

#criar manualmente um contraste – \u00e9 importante quando o fator tratamento tem v\u00e1rios n\u00edveis, <\/span>exemplo frio, sal, calor, dose1, dose2<\/span>
\ncontrast <- results(dds, name=”tratamento_frio_vs_sal”)
\ncontrast <- results(dds, contrast=c(“tratamento”,”frio”,”sal”))
\ncontrast<\/p>\n

#o shrinkage” (ou encolhimento) dos valores de log2 da raz\u00e3o de express\u00e3o (logfold changes) \u00e9 uma <\/span>t\u00e9cnica usada no deseq2 para melhorar os valores da express\u00e3o diferencial<\/span>
\n#deve ser utilizada em situa\u00e7\u00f5es onde h\u00e1 poucos dados ou com muita variabilidade<\/span>
\n#o apeglm \u00e9 um m\u00e9todo bayesiano aplicado nestas condi\u00e7\u00f5es<\/span>
\n#existem outros m\u00e9todos, mas protocolo dos autores do deseq2 ele indica este m\u00e9todo<\/span><\/p>\n

resLFC <- lfcShrink(dds, coef=”tratamento_frio_vs_sal”, type=”apeglm”)
\nresLFC<\/p>\n

 <\/p>\n

#plotar gr\u00e1ficos de dispersao dos resultados de log2fc
\nplotMA(res, ylim=c(-2,2))
\nplotMA(resLFC, ylim=c(-2,2))<\/p>\n

#ajustar os dados<\/span>
\n#Variance Stabilizing Transformation (vst) transforma dos dados de contagem<\/span>
\n#para quye a variabilidade entre as amostras seja estabilizada<\/span>
\n#ele “homogeniza as vari\u00e2ncia” <\/span>
\n#rlog (regularized log transformation) \u00e9 outro metodo com a mesma finalidade<\/span>
\n#blind=FALSE utiliza informa\u00e7\u00f5es das condicoes do experimento para os calculos <\/span>
\n#normTransform – para reduzir outliers<\/span>
\n# todas sao transforma\u00e7\u00f5es<\/span><\/p>\n

#neste exemplo vamos utilizar os dados transformados via rlog<\/span>
\n#conforme artigo https:\/\/doi.org\/10.1186\/s13059-014-0550-8<\/span><\/p>\n

vsd <- vst(dds, blind=FALSE)
\nrld <- rlog(dds, blind=FALSE)
\nntd <- normTransform(dds)
\nhead(assay(vsd), 3)<\/p>\n

meanSdPlot(assay(ntd))
\nmeanSdPlot(assay(vsd))
\nmeanSdPlot(assay(rld))<\/p>\n

# plotar gr\u00e1fico de distancia de PCA entre as amostras<\/span><\/p>\n

sampleDists <- dist(t(assay(rld)))
\nsampleDistMatrix <- as.matrix(sampleDists)
\nrownames(sampleDistMatrix) <- paste(rld$id)
\ncolnames(sampleDistMatrix) <- NULL
\ncolors <- colorRampPalette( rev(brewer.pal(9, “Blues”)) )(255)<\/p>\n

pheatmap(sampleDistMatrix,
\nclustering_distance_rows=sampleDists,
\nclustering_distance_cols=sampleDists,
\ncol=colors)<\/p>\n

plotPCA(rld, intgroup=c(“id”))
\nplotPCA(rld, intgroup=c(“tratamento”))<\/p>\n

resultados:<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

 <\/p>\n

#https:\/\/bioconductor.org\/packages\/devel\/bioc\/vignettes\/EnhancedVolcano\/inst\/doc\/EnhancedVolcano.html<\/span><\/p>\n

#gr\u00e1fico v0lcano – neste caso como a amostra\u00a0<\/span>
\nEnhancedVolcano(res,lab = ”, x = ‘log2FoldChange’, y = ‘pvalue’)
\nEnhancedVolcano(res,lab = ”, x = ‘log2FoldChange’, y = ‘pvalue’) + coord_flip()<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

 <\/p>\n

criar dataframe contendo os DEGs<\/span>
\nfinal <- as.data.frame(res)
\nhead(final)<\/h2>\n

\"\"<\/p>\n

#boxplot das amostras<\/span>
\npar(mar=c(8,5,2,2))
\nboxplot(log10(assays(dds)[[“cooks”]]), range=0, las=2)<\/p>\n

 <\/p>\n

##criar heatmaps<\/span>
\nlibrary(gplots)<\/p>\n

dados1 <- assay(rld)<\/p>\n

#qdo quiser selecionar somente as primeiras 1000 linhas ou outro valor<\/span>
\n#dados1 <- dados1[1:10000,]<\/span><\/p>\n

#aqui utilizaremos todos os dados<\/span><\/p>\n

pheatmap(as.matrix(dados1),
\ncolor=greenred(75),
\nshow_rownames = FALSE,
\ncluster_rows=TRUE,
\ncluster_cols=FALSE)<\/p>\n

resultado:<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

 <\/p>\n

pheatmap(as.matrix(dados1),
\nshow_rownames = FALSE,
\ncluster_cols=FALSE,
\ncolorRampPalette(c(“darkgreen”, “black”, “darkred”))(75),
\nborder_color = “black”, # default is grey60
\nnumber_color = “black”,
\nfontsize_number = 8
\n)<\/p>\n

pheatmap(as.matrix(dados1),
\nshow_rownames = FALSE,
\ncluster_cols=FALSE,
\ncolorRampPalette(c(“darkgreen”, “white”, “darkred”))(75),
\nborder_color = “black”, # default is grey60
\nnumber_color = “black”,
\nfontsize_number = 8
\n)<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

 <\/p>\n

#mais modelos de heatmaps<\/span><\/h2>\n

anotacao <- data.frame(exp_design$tratamento)
\nrow.names(anotacao) <- colnames(dados1)
\ncolnames(anotacao)[1] =”tratamento”
\nanotacao<\/p>\n

cores = list(
\ntratamento = c( frio = “blue”,
\nsal = “magenta”)
\n)<\/p>\n

pheatmap(as.matrix(dados1),
\nshow_rownames = FALSE,
\ncluster_cols=FALSE,
\ncolorRampPalette(c(“darkgreen”, “white”, “darkred”))(75),
\nborder_color = “black”,
\nnumber_color = “black”,
\nfontsize_number = 8,
\nannotation_col = anotacao)<\/p>\n

pheatmap(as.matrix(dados1),
\nshow_rownames = FALSE,
\ncluster_cols=FALSE,
\ncolorRampPalette(c(“darkgreen”, “white”, “darkred”))(75),
\nborder_color = “black”,
\nnumber_color = “black”,
\nfontsize_number = 8,
\nannotation_col = anotacao,
\nannotation_colors = cores)<\/p>\n

 <\/p>\n

pheatmap(dados1,
\ncluster_rows = TRUE,
\ncluster_cols = TRUE,
\nclustering_distance_cols = ‘euclidean’,
\nclustering_distance_rows = ‘euclidean’,
\nclustering_method = ‘ward.D’,
\nannotation_names_row = FALSE,
\nannotation_names_col = TRUE,
\nfontsize_row = 10, # fonte das linhas
\nfontsize_col = 14, # fonte das colunas
\nangle_col = 45, # anglo das caixas de texto
\nshow_colnames = T,
\nshow_rownames = F,
\ncolorRampPalette(c(“darkgreen”, “white”, “darkred”))(75),
\nannotation_col = anotacao,
\nannotation_colors = cores,
\ncutree_cols = 2
\n)<\/p>\n

 <\/p>\n

\"\"<\/p>\n

 <\/p>\n

\"\"<\/p>\n

#centralizando (normalizando) os dados no heatmap<\/span><\/p>\n

normalizado <- as.data.frame(scale(dados1))<\/p>\n

pheatmap(normalizado,
\ncluster_rows = TRUE,
\ncluster_cols = TRUE,
\nclustering_distance_cols = ‘euclidean’,
\nclustering_distance_rows = ‘euclidean’,
\nclustering_method = ‘ward.D’,
\nannotation_names_row = FALSE,
\nannotation_names_col = TRUE,
\nfontsize_row = 10, # fonte das linhas
\nfontsize_col = 14, # fonte das colunas
\nangle_col = 45, # anglo das caixas de texto
\nshow_colnames = T,
\nshow_rownames = F,
\ncolorRampPalette(c(“darkgreen”, “white”, “darkred”))(75),
\nannotation_col = anotacao,
\nannotation_colors = cores,
\ncutree_cols = 2
\n)<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

#dados2 <- dados1[1:5000,]
\ndados2 <- dados1
\nnormalizado <- as.data.frame(scale(dados2))<\/p>\n

heatmap.2(dados2,
\nkey=T,
\nkeysize=1.0,
\nscale=”none”,
\ndensity.info=”none”,
\nreorderfun=function(d,w) reorder(d, w, agglo.FUN=mean),
\ntrace=”none”,
\ncexRow=0.2,
\ncexCol=0.8,
\ndistfun=function(x) dist(x, method=”euclidean”),
\nhclustfun=function(x) hclust(x, method=”ward.D2″))<\/p>\n

heatmap.2(as.matrix(normalizado),
\ndendrogram=”row”,
\ntrace=”none”,
\nlabRow=FALSE,
\ncol=greenred(10))<\/p>\n

heatmap.2(as.matrix(normalizado),
\ndendrogram=”row”,
\ntrace=”none”,
\nlabRow=FALSE,
\ncol=redblue(256))<\/p>\n

n <- nrow(normalizado)
\ncolor <- colorRampPalette((c(“blue”, “white”, “red”)))(n)
\nheatmap.2(as.matrix(normalizado),
\ndendrogram=”row”,
\ntrace=”none”,
\nlabRow=FALSE,
\ncol=color)<\/p>\n

\"\" \"\"<\/p>\n

 <\/p>\n

#correla\u00e7\u00e3o entre as amostras<\/span>
\ndados3 <- dados1
\ndados3[is.na(dados3)] <- 0<\/p>\n

cormat <- round( cor(dados3, method = c(“pearson”)), 2)
\ncormat<\/p>\n

library(reshape2)<\/p>\n

melted_cormat <- melt(cormat)
\nhead(melted_cormat)<\/p>\n

#Get the lower and upper triangles of the correlation matrix
\n#Get lower triangle of the correlation matrix
\nlower_tri <- cormat
\nlower_tri[lower.tri(lower_tri)] <- NA #OR upper.tri function
\nlower_tri<\/p>\n

melted_cormat <- reshape2::melt(lower_tri, na.rm = TRUE)
\n# Heatmap
\nggplot(data = melted_cormat, aes(Var2, Var1, fill = value))+
\ngeom_tile(color = “white”)+
\nscale_fill_gradient2(low = “blue”, high = “red”, mid = “white”,
\nmidpoint = .50, limit = c(0,1), space = “Lab”,
\nname=”Pearson\\nCorrelation”) +
\ntheme_minimal()+
\ntheme(axis.text.x = element_text(angle = 45, vjust = 1,
\nsize = 12, hjust = 1))+
\ncoord_fixed() +
\ngeom_text(aes(Var2, Var1, label = value), color = “black”, size = 4) +
\ntheme(
\naxis.title.x = element_blank(),
\naxis.title.y = element_blank(),
\npanel.grid.major = element_blank(),
\npanel.border = element_blank(),
\npanel.background = element_blank(),
\naxis.ticks = element_blank(),
\nlegend.justification = c(1, 0),
\nlegend.position = c(0.4, 0.7),
\nlegend.direction = “horizontal”)+
\nguides(fill = guide_colorbar(barwidth = 5, barheight = 1,
\ntitle.position = “top”, title.hjust = 0.5))<\/p>\n

\"\"<\/p>\n

 <\/p>\n

##distancia – dendograma entre amostras<\/span>
\nt5 <- t(dados3)
\ndistx = dist(t5, method = “manhattan” )<\/p>\n

distx <- log10(distx)<\/p>\n

hclust_avg <- hclust(distx , method = ‘average’)
\nplot(hclust_avg)<\/p>\n

 <\/p>\n

\"\"<\/p>\n

 <\/p>\n

##mds entre amostras<\/span>
\nfit <- cmdscale(distx, eig = TRUE, k = 2)
\nxx <- data.frame(fit$points[,1])
\nyy <- data.frame(fit$points[,2])
\nnome <- data.frame(row.names(t5))
\nnome<\/p>\n

lin <- c(‘f1′,’f2’, ‘f3’,
\n‘s1′,’s2’, ‘s3’)<\/p>\n

mds1 <- cbind(lin,xx)
\nmds1 <- cbind(mds1,yy)<\/p>\n

colnames(mds1)[1] <- ‘Library’
\ncolnames(mds1)[2] <- ‘Dim1’
\ncolnames(mds1)[3] <- ‘Dim2’<\/p>\n

library(ggthemes)<\/p>\n

ggplot() +
\ngeom_point(data = mds1, aes(x = Dim1, y = Dim2, color = Library),size=4) +
\nscale_color_manual(values = c(“forestgreen”, “palegreen”, “green”,
\n“darkblue”, “blue3”, “dodgerblue”)) +
\ntheme_base()<\/p>\n

 <\/p>\n

\"\"<\/p>\n

 <\/p>\n

 <\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

Protocolo testado utilizando o Linux Ubuntu 24 LTS Os passos iniciais s\u00e3o utilizados para instala\u00e7\u00e3o dos softwares necess\u00e1rios, prepara\u00e7\u00e3o da estrutura de diret\u00f3rios e obten\u00e7\u00e3o dos arquivos utilizados. 1)Instala\u00e7\u00e3o do programa HiSat2: No terminal do linux, utilize o comando: sudo … Continue lendo →<\/span><\/a><\/p>\n","protected":false},"author":1301,"featured_media":0,"parent":0,"menu_order":0,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"footnotes":""},"class_list":["post-278","page","type-page","status-publish","hentry"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/wp.ufpel.edu.br\/lmaia\/wp-json\/wp\/v2\/pages\/278","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/wp.ufpel.edu.br\/lmaia\/wp-json\/wp\/v2\/pages"}],"about":[{"href":"https:\/\/wp.ufpel.edu.br\/lmaia\/wp-json\/wp\/v2\/types\/page"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/wp.ufpel.edu.br\/lmaia\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1301"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/wp.ufpel.edu.br\/lmaia\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=278"}],"version-history":[{"count":51,"href":"https:\/\/wp.ufpel.edu.br\/lmaia\/wp-json\/wp\/v2\/pages\/278\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":406,"href":"https:\/\/wp.ufpel.edu.br\/lmaia\/wp-json\/wp\/v2\/pages\/278\/revisions\/406"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/wp.ufpel.edu.br\/lmaia\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=278"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}